Preclinical study of experimental burns treated with photobiomodulation and Human Amniotic Membrane, both isolated and associated / Estudo pré-clínico de queimaduras experimentais tratadas com fotobiomodulação e membrana amniótica humana, isoladas e associadas / Estudio preclínico de quemaduras experimentales tratadas con fotobiomodulación y membrana amniótica humana, solas y combinadas

Abstract Objective: to evaluate the effect of photobiomodulation with low-level 660 nm laser alone or associated with Human Amniotic Membrane in the repair of partial-thickness burns in rats. Method: an experimental study conducted with 48 male Wistar rats, randomized into four groups: Control, Human Amniotic Membrane, Low-Level Laser Therapy, and Low-Level Laser Therapy associated with Human Amniotic Membrane. The histopathological characteristics of the skin samples were analyzed 7 and 14 days after the burn. The data obtained were submitted to the Kolmogorov-Smirnov and Mann-Whitney tests. Results: the histological analysis of the burn injuries showed a decrease in inflammation (p<0.0001) and an increase in proliferation of fibroblasts (p<0.0001) mainly at 7 days in all treatments related to the control group. At 14 days, the greater effectiveness in accelerating the healing process was significant (p<0.0001) in the Low-Level Laser Therapy group associated with the Human Amniotic Membrane. Conclusion: the association of photobiomodulation therapies with the Human Amniotic Membrane allowed verifying a reduction in the healing process time of the experimental lesions, stimulating its proposal as a treatment protocol in partial-thickness burns.

Resumo Objetivo: avaliar o efeito da fotobiomodulação com laser de baixa intensidade 660 nm isoladamente ou associada à membrana amniótica humana no reparo de queimaduras de espessura parcial em ratos. Método: estudo experimental com 48 ratos Wistar machos, randomizados em quatro grupos: Controle, Membrana Amniótica Humana, Terapia a Laser de Baixa Intensidade e Terapia a Laser de Baixa Intensidade associado à Membrana Amniótica Humana. As características histopatológicas das amostras de pele foram analisadas aos 7 e 14 dias após a queimadura. Os dados obtidos foram submetidos aos testes de Kolmogorov-Smirnov e Mann Whitney. Resultados: a análise histológica das lesões por queimadura mostrou a diminuição da inflamação (p <0,0001) e aumento da proliferação de fibroblastos (p <0,0001), principalmente nos 7 dias em todos os tratamentos relacionados ao grupo controle. Aos 14 dias, a maior efetividade na aceleração do processo cicatricial foi significativa (p<0,0001) no grupo Terapia a Laser de Baixa Intensidade associado à Membrana Amniótica Humana. Conclusão: a associação das terapias de fotobiomodulação à membrana amniótica humana permitiu comprovar redução no tempo do processo cicatricial das lesões experimentais, estimulando sua proposição como protocolo de tratamento em queimaduras de espessura parcial.

Resumen Objetivo: evaluar el efecto de la fotobiomodulación con láser de baja intensidad 660 nm de sola o combinada con la membrana amniótica humana en la reparación de quemaduras de espesor parcial en ratas. Método: estudio experimental con 48 ratas Wistar macho, aleatorizadas en cuatro grupos: Control, Membrana Amniótica Humana, Terapia con Láser de Baja Intensidad y Terapia con Láser de Baja Intensidad combinada con la Membrana Amniótica Humana. Las características histopatológicas de las muestras de piel fueron analizadas a los 7 y 14 días después de la quemadura. Los datos obtenidos fueron sometidos a las pruebas de Kolmogorov-Smirnov y Mann-Whitney. Resultados: el análisis histológico de las lesiones por quemadura mostró una disminución de la inflamación (p <0,0001) y un aumento de la proliferación de fibroblastos (p <0,0001) principalmente a los 7 días en todos los tratamientos en comparación con el grupo control; a los 14 días, en el grupo de Terapia con Láser de Baja Intensidad combinada con la Membrana Amniótica Humana la mayor efectividad en la aceleración del proceso de cicatrización fue significativa (p<0,0001). Conclusión: la asociación de terapias de fotobiomodulación con la membrana amniótica humana permitió comprobar que hubo una reducción en el tiempo del proceso de cicatrización de lesiones experimentales, lo cual favorece que se proponga como protocolo de tratamiento en quemaduras de espesor parcial.

Manejo del embarazo gemelar monocoriónico monoamniótico: revisión de la literatura y reporte de caso

A propósito de la presentación de un caso de embarazo gemelar monocoriónico monoamniótico, se revisó la literatura sobre su diagnóstico y manejo mediante búsqueda electrónica en la base de datos de Medline, OVID, Cochrane y PubMed entre los años 1966 y 2019. Las palabras clave utilizadas en la indagación fueron: embarazo, gemelos, monoamniótico, enredamiento de cordones. Existe un riesgo alto de muerte fetal súbita en gemelos monoamnióticos causado por el enredamiento de los cordones umbilicales, por lo que el diagnóstico oportuno de la corionicidad y amnionicidad en el embarazo gemelar mediante ecografía puede dar la pauta para una vigilancia fetal estrecha y mejorar así el resultado obstétrico.

In view of the presentation of a case of monochorionic monoamniotic twin pregnancy, the literature on its diagnosis and management was reviewed by electronic search in the Medline, OVID, Cochrane, and PubMed databases between 1966 and 2019. The key words used in the inquiry were: pregnancy, twins, monoamniotic, cord entanglement. There is a high risk of sudden fetal death in monoamniotic twins caused by entanglement of the umbilical cords, so timely diagnosis of chorionicity and amnionicity in twin pregnancy by ultrasonography may provide guidance for close fetal surveillance and thus improve obstetric outcome.

Aislación y caracterización de las células epiteliales del amnios / Isolation and characterization of amniotic ephitelial cells

RESUMEN: Las células epiteliales del amnios (hAECs) son células madre pluripotenciales; tienen capacidad de diferenciarse en células de las tres capas embrionarias. Como tales, se utilizan en algunas terapias regenerativas en medicina. Este estudio tiene por objetivo describir un protocolo de aislación de las células epiteliales del amnios (hAECs) a partir de placentas humanas de partos por cesárea, así como su caracterización y comportamiento in vitro. Se aislaron hAECs de 20 placentas de partos por cesárea con un protocolo optimizado. Se caracterizaron las células mediante citometría de flujo, microscopia óptica y de fluorescencia, y se evaluó la proliferación de las células mediante MTT a los 1, 3, 5 y 7 días con y sin β-mercaptoetanol en el medio de cultivo. El análisis histológico del amnios mostró un desprendimiento prácticamente completo de las células después de la segunda digestión del amnios. El promedio de células obtenidas fue de 10.97 millones de células por gramo de amnios. Las hAECs mostraron una proliferación limitada, la cual no fue favorecida por la adición de β-mercaptoetanol en el cultivo. Se observó un cambio de morfología espontanea de epitelial a mesenquimal después del cuarto pasaje. Las células epiteliales del amnios pueden ser aisladas con un protocolo simple y efectivo, sin embargo, presentan escasa capacidad proliferativa. Bajo las condiciones de este estudio, la adición de β-mercaptoetanol no favorece la capacidad proliferativa de las células.

SUMMARY: human amnion epithelial cells (hAECs) are pluripotent stem cells; they have the ability to differentiate into cells of the three embryonic layers, and are used in various regenerative therapies in medicine. This study aims to describe a protocol for the isolation of amnion epithelial cells (hAECs) from human placentas from cesarean delivery, as well as their characterization and culture conditions in vitro. hAECs were isolated from 20 cesarean delivery placentas with an optimized protocol. The cells were characterized by flow cytometry, light and fluorescence microscopy, and the proliferation of the cells was evaluated by MTT at 1, 3, 5 and 7 days with and without β-mercaptoethanol in the culture medium. Histological analysis of the amnion showed a practically complete detachment of the cells of the underlying membrane after the second digestion. The average number of cells obtained was 10.97 million cells per amnion. The hAECs perform a limited proliferation rate, which was not favored by the addition of β-mercaptoethanol in the culture. A spontaneous morphology change from epithelial to mesenchymal morphology is exhibited after the fourth passage. The epithelial cells of the amnion can be isolated with a simple and effective protocol, however, they present little proliferative capacity. Under the conditions of this study, the addition of β-mercaptoethanol does not favor the proliferation of the cells.

Curación de úlcera venosa crónica de la pierna con aloinjerto de membrana amniocoriónica humana fresca / Healing of a chronic ulcer of the lower limb of venous origin with fresh human amniochorionic membrane allograft

En su estado fresco, la membrana amniocoriónica contiene varias células multipotenciales, factores de crecimiento y proteínas de la matriz extracelular que contribuyen a la cicatrización de las úlceras vasculares crónicas. Para demostrar su efectividad, se recurrió a un aloinjerto de membrana placentaria humana fresca para tratar una úlcera venosa crónica, de 12 x 10 cm y con 40 años de evolución, en el zona maleolar interna e izquierda de una paciente de 89 años de edad. Transcurridos 60 días del injerto, la úlcera se encontraba cicatrizada en el 100 % de su superficie, observándose una cicatriz rosada clara en cuyos bordes se apreciaron intentos de pigmentación. El aloinjerto de membrana amniocoriónica humana fresca es una alternativa terapéutica para la curación de úlceras vasculares crónicas persistentes en las extremidades inferiores.

In its fresh state, the amniochorionic membrane contains various multipotential cells, growth factors, and extracellular matrix proteins that contribute to the healing of chronic vascular ulcers. To demonstrate its effectiveness, a fresh human placental membrane allograft was applied to a chronic venous ulcer in the lower limb of an 89-year-old female patient with a 12 x 10 cm ulcerated lesion of 40 years of evolution in the malleolar area of her left lower limb. Sixty days after the graft, the ulcer was healed in 100% of its surface and a light pink scar on the edges indicated possible pigmentation. Fresh human amniochorionic membrane allograft is a therapeutic alternative for the healing of refractory chronic vascular ulcers of the lower extremities.

Cultivo de células madre limbares en membrana amniótica para reconstrucción de tejido corneal: una comparación de dos métodos / Limbal stem cell culture on amniotic membrane for corneal tissue reconstruction: a comparison of techniques / Cultivo de células mãe limbares em membrana amniótica para reconstrução de tecido corneano: uma comparação de dois métodos

Objetivo: Obtener un cultivo celular de células del limbus corneal en membrana amniótica como soporte por dos métodos diferentes, suspensión y explante, para obtener datos de confluencia, viabilidad y diferenciación en ambos métodos. Métodología: Muestras de LSC (limbal stem cells, por sus siglas en inglés) fueron obtenidas de 16 donantes cadavéricos. Se realizaron seis cultivos de cada muestra, 3 por el método de suspensión y 3 por el método de explante, todo por triplicado. Como control negativo se utilizó membrana amniótica sin LSCs. Las células fueron cultivadas con SHEM, 37°C, 5% CO2 y 95% de humedad. Los cultivos fueron mantenidos por 14 días con un recambio de medio cada 3 días. El día 14 los cultivos fueron analizados para evaluar viabilidad con azul de tripano, confluencia por microscopio y la diferenciación celular con Inmunohistoquímica para detectar citoqueratina 3/12. Resultados: Como resultado de los experimentos mencionados anteriormente, para los métodos de suspensión y explante, se encontró una viabilidad de 98.92% y 98.32%, una confluencia de 55.95% y 48.27%, una concentración celular de 38.83x104 células/ml y 36.484x104 celulas/ml, y una diferenciación de 22.93% y 16.55%, respectivamente. Conclusiones: Aunque éste estudio compare dos métodos, cultivos en suspensión de LSC y cultivo en explante de LSC, ambos con membrana amniótica como soporte, nosotros encontramos una pequeña diferencia en ellos. Como resultado, el cultivo en suspensión fue mejor que el explante, sin embargo los resultados no son conclusivos, por lo tanto es necesario realizar más investigaciones en este campo para lograr una conclusión con respecto al desempeño de estos dos métodos.

Objective: To grow cells on amniotic membrane corneal limbus with two different methods to assess the confluence, viability and differentiation of both.Methods: LSC samples were obtained from 16 deceased donors. Additionally, six cultures were made from each sample, 3 by LSC suspension method and 3 by LSC explant method, all in triplicate. Furthermore, AMs without oral mucosal cells were used as negative control cultures. The cells were seeded with SHEM, 37°C, 5% CO2, 95% humidity. Moreover, the cultures were maintained for 14 days and the culture medium was changed every other day or every 3 days. Also, on the 14th day, the cultures were analyzed to evaluate viability with trypan blue, confluence with microscopy and cell differentiation with immunohistochemistry to detect cytokeratin 3/12.Results: As a result of the experiments mentioned above, for suspension and explant cultures, we found a viability of 98.92% and 98.32%, a confluence of 55.95% and 48.27%, a final cellular concentration of 38.83x104 cells/ml and 36.484x104 cells/ml, and a differentiation of 22.93% and 16.55%, respectively.Conclusions: Although this study compared two methods, LSC suspension culture and LSC explant culture, both with AM as scaffold, we did find a slight difference between them. As a result, the suspension culture was better than the LSC explant culture, but the results are not conclusive. It is necessary to conduct more research in this field to reach a conclusion regarding the behavior of these two methods

Objetivo: Obter um cultivo celular de células do limbus corneano em membrana amniótica como suporte por dois métodos diferentes, suspensão e explante, para obter dados de confluência, viabilidade e diferenciação em ambos métodos. Métodos: Mostras de LSC (limbal stem cells, por suas siglas em inglês) foram obtidas de 16 doadores cadavéricos. Realizaram-se seis cultivos de cada mostra, 3 pelo método de suspensão e 3 pelo método de explante, tudo por triplicado. Como controle negativo se utilizou membrana amniótica sem LSCs. As células foram cultivadas com SHEM, 37°C, 5% CO2 e 95% de umidade. Os cultivos foram mantidos por 14 dias com uma troca de meio cada 3 dias. O dia 14 os cultivos foram analisados para avaliar viabilidade com azul de tripan, confluência por microscópio e a diferenciação celular com Imunoistoquímica para detectar citoqueratina 3/12. Resultados: Como resultado dos experimentos mencionados anteriormente, para os métodos de suspensão e explante, encontrou-se uma viabilidade de 98.92% e 98.32%, uma confluência de 55.95% e 48.27%, uma concentração celular de 38.83x104 células/ml e 36.484x104 células/ml, e uma diferenciação de 22.935% e 16.558%, respectivamente. Conclusão: Ainda que este estudo compare dois métodos, cultivos em suspensão de LSC e cultivo em explante de LSC, ambos com membrana amniótica como suporte, nós encontramos uma pequena diferença neles. Como resultado, o cultivo em suspensão foi melhor do que o explante, no entanto os resultados não são conclusivos, portanto é necessário realizar mais investigações neste campo para conseguir uma conclusão com respeito ao desempenho destes dois métodos

Síndrome de brdaas amnioticas / Amniotic Band Syndrome

Se describe el caso de una paciente de 18 años de edad, natural de Cochabamba, primigesta, con 30 semanas de gestación, con antecedente de ruptura prematura de membranas de 1 mes, a quien se instituye tratamiento médico conservador, en el Hospital Materno Infantil "Germán Urquidi", de Cochabamba, por período de 13 días, donde se administra antibioticoterapia con ampicilina y gentamicina y se induce maduración pulmonar fetal con betametasona. Se realiza Examenes complementarios, ecografía, pruebas de bienestar fetal; presentando una evolución favorable, durante su internación. A pesar de ello la paciente y familiares solicitan su alta. Posterior a la misma (4 días después) reingresa al servicio, con signos clínicos de corioamnionítis y trabajo de parto, por lo que se decide interrumpir el embarazo mediante operación cesárea; dónde se obtiene un recién nacido vivo de sexo masculino, con alteraciones estructurales en extremidades superiores e inferiores, tipo "anillos de constricción", compatibles con Síndrome de Bridas Amnióticas, siendo la probable etiología la ruptura del amnios. Se revisó algunos aspectos de su baja frecuencia, factores de riesgo, diferentes hipótesis etiológicas, diagnóstico y conducta terapéutica.

We describe the case of a 18 years oíd primigrávida, native of Cochabamba, with 30 weeks of gestation, with a history of premature rupture of membranes dated 1 month ago, to whom conservative medical treatment was instituted, in the Materno Infantil "Germán Urquidi" Hospital of Cochabamba, for a period of 13 days, where antibiotic therapy was ad-ministered, pulmonary fetal maturation was induced; laboratory, ultrasound, and fetal wellbeing tests were applied, pre-senting a favorable evolution. The patient and family requested her discharge. Following the discharge, (4 days later) the patient was readmitted to the facility, with clinical signs of chorioamnionitis, and labor process, reason why it was decided to termínate the pregnancy by caesarean section; where a male new born was given birth, with structural changes in upper and lower extremities, like constriction bands, compatible with Amniotic Constriction Bands Syndrome, being the probable etiology of amnion rupture. We reviewed some aspects of its low prevalence, risk factors, different etiological hypotheses, diagnosis and therapeutic management.

Desarrollo de un modelo experimental para la caracterización de la respuesta funcional del corioamnios humano

Objetivo: Este estudio fue diseñado para validar y caracterizar un modelo de cultivo de membranas corioamnióticas (MC) humanas que permita mantenerlas íntegras, viables y reproducir su capacidad de respuesta como tejido, que separa al compartimiento materno-fetal ante diversos estímulos asociados al proceso infeccioso. Material y métodos: Se utilizaron MC de mujeres con 37-40 semanas de gestación, sin trabajo de parto activo, ni señales clínicas y/o microbiológicas de infección cervicovaginal. Las MC fueron sujetadas a una placa de cultivo tipo transwell, que permitió la formación de dos compartimentos independientes delimitados por la membranas que se mantuvieron en cultivo 96 h, se evaluó la integridad estructural mediante resistencia eléctrica transepitelial y análisis histológico. La funcionalidad se midió estimulando de manera independiente o cunjunta amnios y/o corion con 500 ng/mL de lipopolisacárido o 5 ng/mL de IL-1β y cuantificando la secreción de TNFα por ELISA y de Metaloproteasa-9 (MMP-9) por zimografía, respectivamente. Resultados: Las diferentes poblaciones celulares de las MC se mantuvieron metabólicamente viables en el cultivo; los parámetros de integridad indicaron que no presentan cambios morfo-estructurales significativos. El estímulo con IL-1β induce secreción diferencial de MMP-9, que en corion alcanzó su máximo a la 4 h y en amnios a las 24 h. La estimulación selectiva con lipopolisacárido indujo la síntesis diferencial de TNFα, siendo el corion el principal productor con aproximadamente 60%. Conclusiones: El sistema de cultivo de MC propuesto, permite estudiar cuantitativa y cualitativamente la contribución de las distintas poblaciones celulares del corioamnios en la respuesta ante el estímulo diferencial con agentes inmunológico-infecciosos.

Objective: This study was designed to validate and characterize a culture model of human choriamniotic membranes (HCM) that keeps their viability, integrity and capacity to reproduce a response to several stimulus associated to an infectious process, as the tissue that separates the fetal and maternal compartment. Material and methods: We use HCM obtained after delivery by elective cesarean section. Women with 37-40 weeks of gestation without evidence of active labor or presence of clinical an microbiological signs of intrauterine/vaginal infection. The membranes were mounted in transwell devices, allowing testing two independent compartments (chorion and amnion) by physically separating the upper and lower chambers. 500 ng/mL of lipopolysaccharide was added to amniotic or chorionic surface and secretions of TNFα was measured in both compartments by specific enzyme-linked immunosorbent assays and Metalloproteinase-9 (MMP-9) secretions after stimulation with 5 ng/mL of IL-1β. Results: The viability test showed that the different cellular populations of the HCM keep their metabolic viability along 96 h of culture. The integrity parameters showed that the stay without morphologic and structural changes. Functional markers showed that membranes responded differentially to IL-1β stimulus; production of MMP-9 in chorion reached its maximum value at 4 h, while amnion reached it at 24 h. The selective stimulation of chorioamnion with lipopolysaccharide induced a differential synthesis of TNFα; the chorion was the principal producer with approximately 60% of total TNFα. Conclusions: The experimental model allows to study qualitatively and quantitatively the contribution of different cellular regions of the HCM, and its response to differential stimulation with immunologic agents.